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技術文章 / article
新生牛血清白蛋白的提取
2017-09-05 瀏覽次數(shù)：1503
新生牛血清白蛋白（BSA），又稱第五組分，是牛血清中的一種球蛋白，包含583個氨基酸殘基，分子量為66.430 kDa，等電點為4.7。新生牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用，例如在western blot中作為Blocking agent。
新生牛血清白蛋白的提取大致可以分為5步。
1、鹽析：
取離心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）稀釋血清，搖勻后，逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液2mL，邊加邊搖，充分混勻，然后靜止放臵10分鐘，再離心（4000r/min）10min，將上清液傾入試管中。
2、透析：
取玻璃紙一張，折成袋形，將離心后的上清液倒入袋內(nèi)，用線扎緊上口（注意要留有空隙），用玻璃棒懸在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯內(nèi)，使透析袋下半部侵入水中，對蛋白液進行透析，常用玻璃棒攪拌袋外（燒杯中）液體，以縮短透析時間。更換蒸餾水多次，用納氏試劑檢查袋外液體的NH4+，觀察顏色變化，直至袋內(nèi)鹽
分透析完畢。將袋內(nèi)液體傾入試管，即得牛血清白蛋白溶液。
3、電泳：
1）點樣 取一張膜條，將薄膜無光澤面向下，放入培養(yǎng)皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透，取出，用干凈濾紙吸去多余的緩沖液，以薄膜的無光澤面距一端1.5㎝處作點樣線，將牛血清樣品與待測的牛血清白蛋白溶液分別用點樣器在同一張薄膜的點樣線處不同位臵點樣。
2）電泳 將點樣后的膜條臵于電泳槽架上，放臵時膜條無光澤面向下，點樣端臵于陰極，待平衡5min后，打開電源，調節(jié)電泳儀的電壓為160伏，通電60min，關閉電源后用鑷子將膜條取出。
3）染色 將膜條直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分鐘取出，立即浸于漂洗液中，分別在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干凈為止，用濾紙吸干薄膜。
4）鑒定 比較樣品與待測液中白蛋白在薄膜上的電泳結果，看位臵是否一致。
4、 實驗儀器和試劑：
儀器：離心管、離心機、試管、玻璃紙、燒杯、比色磁盤、滴管、玻璃棒、電泳儀、醋酸纖維素薄膜、分光光度計。
試劑：牛血清待測液、牛血清樣品、PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2飽和硫酸銨溶液、納氏試劑、巴比妥緩沖液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氫氧化鈉溶液。
5、預測結果：
位臵一致，實驗成功。若在待測液的電泳結果中出現(xiàn)其他球蛋白的黑帶區(qū)域，則說明提取不夠純。
新生牛血清白蛋白的提取大致可以分為5步。
1、鹽析：
取離心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）稀釋血清，搖勻后，逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液2mL，邊加邊搖，充分混勻，然后靜止放臵10分鐘，再離心（4000r/min）10min，將上清液傾入試管中。
2、透析：
取玻璃紙一張，折成袋形，將離心后的上清液倒入袋內(nèi)，用線扎緊上口（注意要留有空隙），用玻璃棒懸在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯內(nèi)，使透析袋下半部侵入水中，對蛋白液進行透析，常用玻璃棒攪拌袋外（燒杯中）液體，以縮短透析時間。更換蒸餾水多次，用納氏試劑檢查袋外液體的NH4+，觀察顏色變化，直至袋內(nèi)鹽
分透析完畢。將袋內(nèi)液體傾入試管，即得牛血清白蛋白溶液。
3、電泳：
1）點樣 取一張膜條，將薄膜無光澤面向下，放入培養(yǎng)皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透，取出，用干凈濾紙吸去多余的緩沖液，以薄膜的無光澤面距一端1.5㎝處作點樣線，將牛血清樣品與待測的牛血清白蛋白溶液分別用點樣器在同一張薄膜的點樣線處不同位臵點樣。
2）電泳 將點樣后的膜條臵于電泳槽架上，放臵時膜條無光澤面向下，點樣端臵于陰極，待平衡5min后，打開電源，調節(jié)電泳儀的電壓為160伏，通電60min，關閉電源后用鑷子將膜條取出。
3）染色 將膜條直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分鐘取出，立即浸于漂洗液中，分別在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干凈為止，用濾紙吸干薄膜。
4）鑒定 比較樣品與待測液中白蛋白在薄膜上的電泳結果，看位臵是否一致。
4、 實驗儀器和試劑：
儀器：離心管、離心機、試管、玻璃紙、燒杯、比色磁盤、滴管、玻璃棒、電泳儀、醋酸纖維素薄膜、分光光度計。
試劑：牛血清待測液、牛血清樣品、PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2飽和硫酸銨溶液、納氏試劑、巴比妥緩沖液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氫氧化鈉溶液。
5、預測結果：
位臵一致，實驗成功。若在待測液的電泳結果中出現(xiàn)其他球蛋白的黑帶區(qū)域，則說明提取不夠純。
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