這些細(xì)胞培養(yǎng)的常識(shí)，你掌握了嗎？

1.如何選擇培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類(lèi)型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長(zhǎng)。總之， MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)的是 AIM V 培養(yǎng)基（SFM）。

2.為什么要熱滅活血清？

加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng) ES 細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。

3.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終確定。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I 是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用 GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I 二肽是 L-谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的 α-氨基用 L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定，即使在 121 磅滅菌 20 分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

5.為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

6.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？

用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到 200-2000 個(gè)/毫升，在 0.1 毫升的細(xì)胞中加入 0.1 毫升的 0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。

7.如何消除組織培養(yǎng)的污染？

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查 HEPA 過(guò)濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素 B 和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。

1)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

2)分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素 B 推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3)每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度 2-3 倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 2-3 代。

5)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

6)重復(fù)步驟 4。

7)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4-6 代，確定污染是否以已被消除。

8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要 CO2 培養(yǎng)箱。原因是什么？

Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和 Earle’s 平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在 Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡，以維持溶液的PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hanks 液在 CO2 培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在 CO2 培養(yǎng)箱中保存組織，需要用 Eagles 液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用 Hanks 液就可以了。

10.Qualified 和 Certified 胎牛血清有什么差別?

Certified 胎牛血清包括了 Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，Certified 胎牛血清還有如下一些附加的檢測(cè)：

End-Point Determination of Endotoxin Content

噬菌體檢驗(yàn)

生物化學(xué)檢測(cè)

激素的檢測(cè)

血紅蛋白檢測(cè)

Sf9 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)及方法學(xué)檢測(cè)

11.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入 EDTA 的目的是什么？

二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用 EDTA 清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

12.制備 lipid-DNA 的方法會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率嗎？

是的。對(duì)于 LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在 100µl OPTI-MEM 中，稀釋 DNA 在 100µl OPTI-MEM 中。混合兩種溶液在室溫下孵育 15 分鐘。對(duì)于 LIPOFECTIN Reagent，在加入 DNA 溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少 30 分鐘可以增加 3 倍的效率。確保復(fù)合物在沒(méi)有血清的情況下形成。孵育 15 分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800µl）。（注意以上是 35mm 培養(yǎng)皿使用體積）。對(duì)于 LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA 應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與 Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000 的操作步驟允許在一個(gè)很小的體積下混合 DNA 和脂質(zhì)體，接下來(lái)可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。

13.我使用 SF900 Ⅱ時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用 Graces 液和 10%胎牛血清時(shí)效果好？

如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會(huì)作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無(wú)血清配方中，蛋白酶作用的底物是你的目的蛋白。為了避免這一問(wèn)題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于 1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

14.如何檢測(cè)內(nèi)毒素(熱源)水平？

LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗(yàn)是可用的最敏感和特異的檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。Levin 和 Bang 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動(dòng)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)），通過(guò)修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL 中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟（血細(xì)胞）裂解物。

胎牛血清的內(nèi)毒素檢測(cè)是在 Grand Island，按照手冊(cè)上 Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對(duì)血清產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)前，用無(wú)熱源的水 1：10 稀釋樣品。稀釋樣品沸水育 5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會(huì)抑制凝膠過(guò)程，使內(nèi)毒素不能與 LAL 反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。）

15.我可以使用固體形式的 Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？

如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免 MS 培養(yǎng)基的直接滅菌，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到 MS 培養(yǎng)基中。

16. 20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下 PH 值會(huì)改變嗎？

對(duì)于普通使用的緩沖液，PH 值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變 10℃時(shí)，PH 值的變化情況

例如 20℃下配制 PH7.4 Tris 緩沖液,40℃時(shí) PH 值為 7.4-（2x0.310）＝6.78

17. 室溫下(25℃)配制的 Tris-HCl 溶液，在 37℃使用時(shí) PH 值是多少？

緩沖液的 PH 值隨溫度變化而變化。下表列出了 50mM Tris-HC 溶液在 4℃，25℃，37℃時(shí)，不同的 PH 值。

4°C 25°C 37°C

8.1 7.5 7.2

8.2 7.6 7.3

8.3 7.7 7.4

8.4 7.8 7.5

8.5 7.9 7.6

8.6 8.0 7.7

8.7 8.1 7.8

8.8 8.2 7.9

8.9 8.3 8.0

9.0 8.4 8.1

9.1 8.5 8.2

9.2 8.6 8.3

9.3 8.7 8.4

9.4 8.8 8.5

18. 昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)的最適 PH 值和滲透壓是多少？

生長(zhǎng)培養(yǎng)基的 PH 值對(duì)細(xì)胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì)產(chǎn)生影響。對(duì)于大部分鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細(xì)胞系，在 PH 值 6.0-6.4 范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細(xì)胞系時(shí)，培養(yǎng)基的最適滲透壓是 345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問(wèn)題，保持 PH 值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。

19. High Five 細(xì)胞有任何其它名稱(chēng)嗎？

High Five 細(xì)胞也被稱(chēng)為 Trichoplasia ni 5B1-4 和 BTI-TN-5B1-4。

20.在 High Five 無(wú)血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少？

High Five 無(wú)血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

21.High Five 細(xì)胞用多大的密度凍存？

3.0x10E6 cells/ml

22.在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對(duì)我的細(xì)胞有害嗎？

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是 L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的 2mM 高 6 倍。酪氨酸的濃度比在 RPMI 1640 中高 25 倍，而且比谷氨酰胺更

加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解，對(duì)實(shí)驗(yàn)不會(huì)有不利的影響。

23.如何從 T25 瓶中轉(zhuǎn)移 sf9 細(xì)胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們強(qiáng)力推薦使用脫落細(xì)胞的方法，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)破壞性最小，生活力最高。通過(guò)使用巴氏德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。

只有在絕對(duì)必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。

胰酶消化一個(gè) T25 瓶的 sf9 細(xì)胞：

1)去除培養(yǎng)基。

2) 用 2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除 PBS.

3) 加入 2ml 1x 胰酶 EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。

4) 37 ℃孵育 5 到 10 分鐘。在儀器下檢測(cè)看到 5 分鐘后它們正在向上移動(dòng)。

5) 向細(xì)胞中加入 2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用 2ml 培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的 FBS 終止了胰酶的活性。）

6) 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。

7) 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。

24.在 Sf9, Sf21, 和 high Five 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為 10 單位/毫升細(xì)胞懸液。

25.如何評(píng)估 ES 細(xì)胞合格的胎牛血清？

使用 D3 ES 細(xì)胞。這是一個(gè)對(duì)于胎牛血清中生長(zhǎng)促進(jìn)、生長(zhǎng)抑制和分化因子非常敏感的細(xì)胞系。相關(guān)生長(zhǎng)效率分析：當(dāng) ES 細(xì)胞以非常低的密度傳入包含 10％胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，檢測(cè)開(kāi)始和支持 ES 細(xì)胞克隆的能力。

細(xì)胞毒分析：

當(dāng)以非常低的密度傳入包含 30％胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，檢測(cè) ES 細(xì)胞和 feeder 細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。

相關(guān)形態(tài)學(xué)和分化分析：

檢測(cè)胎牛血清支持未分化 ES 細(xì)胞克隆的能力。通過(guò)堿性磷酸酶活性評(píng)估分化程度。未分化的 ES 細(xì)胞小顏色深紅粉紅，分化的細(xì)胞較大，豐滿，顏色較淺。

所有的分析在沒(méi)有 ESGRO 的情況下進(jìn)行的，培養(yǎng)基中出現(xiàn) ESGRO 會(huì)掩蓋由胎牛血清所導(dǎo)致的問(wèn)題。（ESGRO 或 LIF 經(jīng)常用來(lái)保持 ES 細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。）

經(jīng)過(guò)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大約 8 批中有 1 批可以用來(lái)培養(yǎng) ES 細(xì)胞。

26.在重新凍存 sf9 細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會(huì)降低嗎？

通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò) 30 次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無(wú)論什么時(shí)候記數(shù)時(shí)，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過(guò) 95％的細(xì)胞保持有活力和在大約 30 小時(shí)左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。