1.如何選擇培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長。總之， MEM 做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640 做懸浮細胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的是 AIM V 培養(yǎng)基（SFM）。

2.為什么要熱滅活血清？

加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養(yǎng) ES 細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

3.L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I 是什么？培養(yǎng)細胞如何利用 GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I 二肽是 L-谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的 α-氨基用 L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定，即使在 121 磅滅菌 20 分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

5.為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

6.如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞？

用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到 200-2000 個/毫升，在 0.1 毫升的細胞中加入 0.1 毫升的 0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。

7.如何消除組織培養(yǎng)的污染？

當重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查 HEPA 過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素 B 和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1)在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。

2)分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素 B 推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3)每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度 2-3 倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞 2-3 代。

5)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。

6)重復步驟 4。

7)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4-6 代，確定污染是否以已被消除。

8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要 CO2 培養(yǎng)箱。原因是什么？

Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和 Earle’s 平衡鹽溶液（EBS）有什么本質的功能差別？HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在 Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡，以維持溶液的PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中，溶液會變堿，Hanks 液在 CO2 培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在 CO2 培養(yǎng)箱中保存組織，需要用 Eagles 液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用 Hanks 液就可以了。

10.Qualified 和 Certified 胎牛血清有什么差別?

Certified 胎牛血清包括了 Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標準檢驗程序，而且除了這些標準檢測，Certified 胎牛血清還有如下一些附加的檢測：

End-Point Determination of Endotoxin Content

噬菌體檢驗

生物化學檢測

激素的檢測

血紅蛋白檢測

Sf9 細胞生長促進及方法學檢測

11.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入 EDTA 的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用 EDTA 清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

12.制備 lipid-DNA 的方法會影響轉染效率嗎？

是的。對于 LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在 100µl OPTI-MEM 中，稀釋 DNA 在 100µl OPTI-MEM 中。混合兩種溶液在室溫下孵育 15 分鐘。對于 LIPOFECTIN Reagent，在加入 DNA 溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少 30 分鐘可以增加 3 倍的效率。確保復合物在沒有血清的情況下形成。孵育 15 分鐘后，在復合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800µl）。（注意以上是 35mm 培養(yǎng)皿使用體積）。對于 LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA 應該在與脂質體混合之前首先與 Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000 的操作步驟允許在一個很小的體積下混合 DNA 和脂質體，接下來可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。

13.我使用 SF900 Ⅱ時，細胞生長良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用 Graces 液和 10%胎牛血清時效果好？

如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于 1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

14.如何檢測內毒素(熱源)水平？

LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的最敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin 和 Bang 發(fā)現(xiàn)細菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內的凝集作用。內毒素啟動一個細胞內酶原系統(tǒng)（絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應系統(tǒng)），通過修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL 中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質。LAL試劑緩沖的鱟（血細胞）裂解物。

胎牛血清的內毒素檢測是在 Grand Island，按照手冊上 Gel-clot 方法進行的。在對血清產(chǎn)品進行內毒素檢測前，用無熱源的水 1：10 稀釋樣品。稀釋樣品沸水育 5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內毒素結合成份的出現(xiàn)會抑制凝膠過程，使內毒素不能與 LAL 反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。）

15.我可以使用固體形式的 Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？

如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免 MS 培養(yǎng)基的直接滅菌，應該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到 MS 培養(yǎng)基中。

16. 20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下 PH 值會改變嗎？

對于普通使用的緩沖液，PH 值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變 10℃時，PH 值的變化情況

例如 20℃下配制 PH7.4 Tris 緩沖液,40℃時 PH 值為 7.4-（2x0.310）＝6.78

17. 室溫下(25℃)配制的 Tris-HCl 溶液，在 37℃使用時 PH 值是多少？

緩沖液的 PH 值隨溫度變化而變化。下表列出了 50mM Tris-HC 溶液在 4℃，25℃，37℃時，不同的 PH 值。

4°C 25°C 37°C

8.1 7.5 7.2

8.2 7.6 7.3

8.3 7.7 7.4

8.4 7.8 7.5

8.5 7.9 7.6

8.6 8.0 7.7

8.7 8.1 7.8

8.8 8.2 7.9

8.9 8.3 8.0

9.0 8.4 8.1

9.1 8.5 8.2

9.2 8.6 8.3

9.3 8.7 8.4

9.4 8.8 8.5

18. 昆蟲細胞培養(yǎng)的最適 PH 值和滲透壓是多少？

生長培養(yǎng)基的 PH 值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系，在 PH 值 6.0-6.4 范圍的大部分應用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細胞系時，培養(yǎng)基的最適滲透壓是 345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養(yǎng)方式，減少技術問題，保持 PH 值和滲透壓在以上所列的范圍之內。

19. High Five 細胞有任何其它名稱嗎？

High Five 細胞也被稱為 Trichoplasia ni 5B1-4 和 BTI-TN-5B1-4。

20.在 High Five 無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少？

High Five 無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

21.High Five 細胞用多大的密度凍存？

3.0x10E6 cells/ml

22.在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細胞有害嗎？

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是 L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的 2mM 高 6 倍。酪氨酸的濃度比在 RPMI 1640 中高 25 倍，而且比谷氨酰胺更

加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解，對實驗不會有不利的影響。

23.如何從 T25 瓶中轉移 sf9 細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術破壞性最小，生活力最高。通過使用巴氏德吸液管，讓細胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。

只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。

胰酶消化一個 T25 瓶的 sf9 細胞：

1)去除培養(yǎng)基。

2) 用 2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除 PBS.

3) 加入 2ml 1x 胰酶 EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。

4) 37 ℃孵育 5 到 10 分鐘。在儀器下檢測看到 5 分鐘后它們正在向上移動。

5) 向細胞中加入 2ml 細胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用 2ml 培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的 FBS 終止了胰酶的活性。）

6) 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養(yǎng)基。

7) 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。傳代。

24.在 Sf9, Sf21, 和 high Five 細胞懸浮培養(yǎng)時，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成，使用肝素濃度為 10 單位/毫升細胞懸液。

25.如何評估 ES 細胞合格的胎牛血清？

使用 D3 ES 細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。相關生長效率分析：當 ES 細胞以非常低的密度傳入包含 10％胎牛血清的生長培養(yǎng)基中，檢測開始和支持 ES 細胞克隆的能力。

細胞毒分析：

當以非常低的密度傳入包含 30％胎牛血清的生長培養(yǎng)基中，檢測 ES 細胞和 feeder 細胞的生長能力。

相關形態(tài)學和分化分析：

檢測胎牛血清支持未分化 ES 細胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的 ES 細胞小顏色深紅粉紅，分化的細胞較大，豐滿，顏色較淺。

所有的分析在沒有 ESGRO 的情況下進行的，培養(yǎng)基中出現(xiàn) ESGRO 會掩蓋由胎牛血清所導致的問題。（ESGRO 或 LIF 經(jīng)常用來保持 ES 細胞處于未分化狀態(tài)。）

經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大約 8 批中有 1 批可以用來培養(yǎng) ES 細胞。

26.在重新凍存 sf9 細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當細胞經(jīng)過 30 次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候記數(shù)時，都應該檢查細胞活力。如果超過 95％的細胞保持有活力和在大約 30 小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。