細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞凍存注意事項

一、怎樣凍存動物細(xì)胞?

一個實驗室得到一個新的細(xì)胞株后，首先要把該細(xì)胞株培養(yǎng)擴(kuò)增后凍存起來。細(xì)胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細(xì)胞時有備份可用，另外幾乎所有細(xì)胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實驗結(jié)果的一致，一般細(xì)胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細(xì)胞化凍培養(yǎng)再使用。

細(xì)胞冷凍過程有四個要點：細(xì)胞的收獲、保護(hù)劑的使用、冷凍速率和儲存環(huán)境。

(1) 細(xì)胞的收獲

用來凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞約鋪滿 90% 的時候，這時細(xì)胞生長狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多，并且在收獲細(xì)胞前 24 小時換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存的細(xì)胞開始時方法和平時一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細(xì)胞再重懸，活細(xì)胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細(xì)胞保存的最終細(xì)胞濃度的二倍(一般是 400-1000 萬 細(xì)胞 /ml )，加入已經(jīng)配好的等體積的培養(yǎng)液保護(hù)劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。

(2) 保護(hù)劑的使用

細(xì)胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護(hù)劑。在細(xì)胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細(xì)胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細(xì)胞特別是雜交瘤細(xì)胞在凍存時使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會好些。保護(hù)劑在使用時先用培養(yǎng)液或血清配成最終濃度的2倍，再與等體積的懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液混合。

(3) 細(xì)胞凍存的速率

細(xì)胞的冷凍速率最適控制在讓細(xì)胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導(dǎo)致細(xì)胞損害。對大多數(shù)細(xì)胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。通常的操作是把細(xì)胞先在-20℃1-2個小時，再放入 -80℃冰箱過夜(如果沒有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再轉(zhuǎn)入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長期保存。

(4) 儲存環(huán)境

細(xì)胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細(xì)胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因為這樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細(xì)胞時引起爆炸(但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲少量液氮，需要經(jīng)常添加)。細(xì)胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。

二、怎樣化凍動物細(xì)胞?

● 化凍過程的原則是要讓凍存的細(xì)胞快速融化。

● 如果細(xì)胞儲存在液氮液面下，使用者最好準(zhǔn)備好必要的防護(hù)器具(至少要戴上護(hù)目鏡，最好戴上面罩和較厚的手套)，防止進(jìn)入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害。從冰箱或液氮罐取出細(xì)胞后將凍存管放37℃水浴輕輕晃動使之化凍*，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發(fā)生。

● 由于大多防凍劑與細(xì)胞長時間接觸時對細(xì)胞有毒害，所以最好盡快除去細(xì)胞凍存時加入的防凍劑。

● 防凍劑的去除方式和細(xì)胞的敏感性有關(guān)。有些細(xì)胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長，可以直接將化凍的凍存細(xì)胞連同其凍存液加入預(yù)備好15-20ml

培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后換培養(yǎng)液。

● 對于敏感細(xì)胞要加入 10ml 培養(yǎng)液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養(yǎng)液輕輕重懸細(xì)胞，加入培養(yǎng)器皿后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第二天更換培養(yǎng)液。