細胞培養遇到支原體污染，應當怎么應對？

細胞培養物被支原體污染是極普遍的問題，面對支原體污染給細胞培養帶來的巨大難題，世界各國開始重視，并相繼建立了細胞庫，對細胞質量進展控制，支原體污染的問題得以限制。目前已知能污染細胞的支原體有20多種以上，其中95％以上的支原體污染是口腔支原體。

目前已知的主要污染源是動物血清、胰酶和已污染培養物的氣溶膠，例如，豬鼻支原體通過胰酶，在消化細胞時進入細胞培養物，并造成污染。在原代細胞與傳代細胞的檢測中，原代細胞與傳代細胞分離出支原體的頻率是有明顯差異的，傳代次數越多的細胞，污染支原體的可能性就越大，這也是多次與動物血清、胰酶和已污染培養物的氣溶膠接觸后造成的，在原代細胞中，污染率低于4%，而傳代細胞的污染率則高達57%~92%。

支原體的介紹
 

支原體是目前已知一類能在無生命培養基上生長繁殖的最小的原核細胞微生物，分為兩個屬：一為支原體屬（Mycoplasma），有幾十個種；另一為脲原體屬（Ureaplasma），僅有一種。革蘭染色為陰性，但不易著色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。

支原體在自然界分布廣泛，無細胞壁，直徑為0.1-0.3μm，且形態易變，極易通過除菌過濾器。大部分支原體繁殖速度比細菌慢，適宜生長溫度為35℃，適合于偏堿條件下生存（pH7.6—8.0），對酸耐受性差，對75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。對熱比較敏感在細胞培養過程中如果在顯微鏡下發現破碎的細胞很多，需要頻繁換液才能維持傳代培養的時候，即應懷疑支原體污染。細胞培養過程中遇到的支原體95%都來自于以下四種支原體：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾支原體，其中萊氏無膽甾支原體為牛源性。

支原體的污染來源
 

（1）細胞之間交叉污染；

（2）細胞培養操作人員的口腔、皮膚等；

（3）工作環境或實驗器材的污染；

（4）培養基的污染。

支原體污染的嚴重性
 

（1）細胞外形可以沒有明顯的變化，支原體可以與細胞共存，污染后細胞液不會死亡，培養基一般不發生渾濁；

（2）使用被支原體污染的細胞做實驗會嚴重影響實驗的結果，因為支原體會抑制細胞生長；導致染色體畸變；細胞膜抗原性改變；細胞復蘇后存活率降低等。

（3）影響細胞的代謝和功能：培養液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細胞蛋白質、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；支原體活動使培養液成分發生改變（如發酵型支原體降解糖類產生酸性物質），影響細胞代謝。

（4）培養過程中細胞破碎較多，培養基pH變化明顯，需要頻繁更換新鮮培養基；

（5）細胞被支原體污染后會形成共生體系導致污染不斷擴大。

支原體污染的檢測及鑒定方法

分離培養法
支原體的病原學檢測主要是從被污染的細胞、雞胚中分離培養出支原體來確定，分離培養法是檢測支原體污染中最為可靠準確的方法。但是支原體對環境的影響敏感，容易被滅活，而且分離培養操作相對繁瑣，所需時間較長，因此只能夠對支原體污染進行定性觀察。分離培養法在常規的支原體檢測中多用于輔助其它檢測方法。

DNA熒光染色法
DNA熒光染色法較分離培養法縮短了檢測周期，主要用于細胞培養中污染支原體的檢測。DNA熒光染色法正是利用熒光染色劑雙苯咪唑（Bisbenzimidzole）Hoechst33258能夠結合支原體DNA中的A-T堿基富集區域的原理，被支原體污染的細胞經染色后，其細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光點，即是富含A-T堿基區域的支原體DNA。

PCR技術
PCR作為一種快速、靈敏、特異且簡便的基因診斷技術已應用于科學研究和疾病的診斷。根據支原體基因組內的保守序列設計特異引物，對待檢樣品的核酸進行擴增，通過對擴增產物的大小分析作出診斷。PCR檢測技術用于支原體污染的檢測，周期短、靈敏度高、特異性好、操作簡單且一次可檢測大量樣品。

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
ELISA用于支原體污染的檢測中，有著良好的特異性和敏感性，一次可以完成大量樣品的檢測。如今已有LONZA等公司開發了針對細胞中污染支原體的檢測試劑盒，具有簡便、快速與定量定性檢測等特點。

電鏡
一般在細胞培養48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。

定期檢測
支原體感染會使培養細胞慢慢枯萎，因此對培養細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應該進行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規化堅持下去，是細胞培養實驗室應對支原體感染的關鍵。
 

細胞污染支原體的預防
 

細胞培養工作中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：

1）控制環境污染

2）嚴格實驗操作

3）細胞培養基和器材要保證無菌

4）在細胞培養基中加入適量的抗生素

　　支原體污染細胞后，有必要清除支原體，常用方法有：

1）對于非重要的細胞，如培養中的細胞、WCB的細胞等，將培養物與用過的培養基滅活后丟棄即可。對于較為重要的細胞，如來源珍貴或實驗室中細胞保藏量較小等可以采用以下（2）-（8）的方法。

2）用MRA處理：用支原體清除劑（Mycoplasma Removal Agent）處理細胞，作用濃度為 25μg/ml，兩周可以清除支原體。

3）用清洗純化法清除支原體污染的方法：細胞營養馴化→優質細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌，其原理是利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低. 如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。

4）藥物輔助加溫處理：先用藥物處理后，再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。

5）使用支原體特異性血清：用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個月后仍為陰性。

6）動物體內接種除菌法：把受支原體污染的腫瘤細胞接種在同種動物皮下或腹腔中，借動物免疫系統消滅支原體，而腫瘤細胞卻能在體內繼續生長，待一定時間后，從體內取出細胞再進行培養繁殖。

7）巨噬細胞吞噬法：從動物腹腔采取巨噬細胞，為排除其它細胞成分，可先進行純化，然后再加入被支原體污染的細胞培養液中混合培養。在培養過程中，為檢查支原體是否已被消除干凈，可利用支持物培養法驗證，取出支持物逐日染色、鏡檢觀察，至支原體已被消除干凈為止。

8）使用支原體清除培養基，每2~3天更換1次新鮮培養液，換液時用無菌的平衡鹽溶液洗滌細胞1~2次；期間如果細胞密度過大，請保持細胞密度適當（貼壁細胞可能需要用胰酶消化），并更換新的培養器皿，3天之后，即可見明顯清除效果；處理15天后，可以用支原體檢測試劑盒進行檢測，檢測支原體是否殺滅*；如果仍有支原體殘留，可以考慮再處理6天；為避免細胞再次受到“支原體"的污染，以后每隔1個月進行支原體的常規檢測，以保證沒有新的支原體污染。

注：支原體污染時細胞表現為長得不好，也不死亡，同時，培養基又是清亮的，時間長達一周也沒有什么變化，這時基本上可以判斷出是支原體污染了。