細胞培養(yǎng)的原理和步驟

細胞培養(yǎng)的基本原理：細胞傳代（生存空間和營養(yǎng)不足，長得太密，代謝廢物太多，要洗洗，同時也要分離出一部分細胞，要加入新的培養(yǎng)液），換液（生存空間和營養(yǎng)剩余，但是代謝廢物太多，要洗洗，要吃飯，才能長好，所以要洗和加入新鮮培養(yǎng)基），凍存（太多了，先存起來，液氮里面里就是低溫，保存能量，活得久），復(fù)蘇（解凍，恢復(fù)吃飯的能力，恢復(fù)生長。）這四步。

細胞培養(yǎng)的基本步驟（一定要明白每個步驟的意義和目的）：

01細胞傳代（貼壁細胞）：

試劑：PBS,胰酶，含血清的培養(yǎng)基；

流程：顯微鏡下看一看培養(yǎng)皿里的細胞多不多，太多（80%~90%）會導(dǎo)致代謝廢物很多，先吸掉廢液，再用PBS洗一洗，同時太多會導(dǎo)致細胞黏在一起，這時候就需要加點胰酶消除它們之間的粘性，是否消除完，在顯微鏡下看一看，看完加入適宜的含血清的培養(yǎng)基，中和一下胰酶，這叫吹打，除此之外，細胞太多了，把一部分細胞移出來，加入適量的培養(yǎng)基放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，這叫傳代。

02細胞換液：

試劑：PBS，含血清的培養(yǎng)基；

流程：先吸掉代謝廢物（即細胞瓶中的培養(yǎng)液），再用PBS洗一洗，由于細胞長得不是很多，細胞之間沒有黏在一起，因此不需要加入胰酶來消除它們之間的粘性。由于細胞要吃飯，加入新鮮的含血清的培養(yǎng)基，最后放到孵箱里面進行培養(yǎng)。

03細胞凍存：

試劑：凍存液，PBS，胰酶，含血清的培養(yǎng)基；

流程：要凍存，先配置凍存液，凍存液包含了：DMSO：防止在低溫（零度以下至-196℃）保存細胞時，細胞內(nèi)液會形成冰晶，滲透壓會發(fā)生改變，細胞結(jié)構(gòu)會出現(xiàn)紊亂，會導(dǎo)致細胞出現(xiàn)損傷。凍存液制備時，一般需與血清一起配置：因為兩者互融時，會散發(fā)熱量，所以凍存液需提前制備。

因為細胞太多了，需要凍存，所以要先看一看，吸一吸，洗一洗，分一分，中和一下，吹打制成細胞懸液，離心，吸掉上清液，加入凍存液，輕輕吹吸均勻，每管等量1ml裝入凍存管，4℃20min,-20℃30min,-80℃過夜，最后放入液氮罐。

04細胞復(fù)蘇：

試劑：含血清的培養(yǎng)基；

流程：從液氮中取出凍存管，迅速（小于3min）置于37℃水浴鍋中，解凍時，邊晃動邊觀察，當看到只有一小塊冰存在時，即可從水浴鍋中取出，打開凍存管，迅速將細胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻，1000r/min,離心五分鐘，吸掉上清液，沉淀中加入適量培養(yǎng)液，放入孵箱中，培養(yǎng)。還有就是：復(fù)蘇的細胞，需要在24小時后，換一次培養(yǎng)液。