★CQ★早期凋亡細胞及活細胞的胞膜正常，DNA染料碘化丙錠(PI)拒染，但可被另外一種DNA染料Hoechst342(Ho342)染色；而壞死細胞的胞膜完整性受到破壞，細胞不需固定即可被PI染色。凋亡細胞的胞膜成分亦發(fā)生改變，在凋亡早期，原來位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至脂雙層外側。另外，細胞凋亡時核酸內切酶被激活，首先將DNA切成50～300kb大小的DNA，然后進一步將染色質裂解成單個核小體和寡聚核小體，形成180～200bp的DNA斷。而壞死細胞DNA斷裂無規(guī)律性。

一、ISOL檢測法

原理：與TUNEL凋亡檢測法類似，ISOL（In Situ Oligo Ligation，原位寡核苷酸片段連接）也是通過末端標記斷裂DNA的方法。但該方法的創(chuàng)新在于利用ISOL方法，在DNA段的平端或3’端單個突出堿基進行連接擴增，鑒于只有發(fā)生凋亡的細胞才會發(fā)生平端或3’端單個堿基突出，所以ApopTag 過氧化物酶ISOL凋亡檢測試劑盒能夠明確的區(qū)分凋亡細胞和壞死細胞。

優(yōu)勢：原位特異標記，能夠zui大限度的降低背景，克服TUNEL法檢測的假陽性，適用于石蠟包埋的組織、冰凍組織、貼壁細胞以及懸浮細胞的凋亡檢測。

二、DNA凝膠電泳(DNAladder)

凋亡過程中DNA裂解是標志細胞zui終走向死亡的不可逆的重要過程，DNA凝膠電泳也曾被認為是細胞凋亡判定的金標準之一。抽提細胞的DNA,確定樣品中DNA的量和純度，然后在瓊脂糖凝膠上電泳。正常活細胞的DNA凝膠電泳為一條區(qū)帶;細胞凋亡時，由于DNA被裂解成單個核小體和寡聚核小體，電泳時呈現特征性的“階梯狀”(ladder)條帶，壞死細胞的DNA是被隨機破壞的，不能形成階梯狀條帶，電泳時出現類似血涂片的連續(xù)性改變。此方法是判斷細胞有無凋亡發(fā)生的一種簡便方法，比較適用于體外培養(yǎng)的非增殖性細胞的檢測。

缺點：

(1)特異性較差，特征性的180～200bpDNA梯帶的出現并非凋亡所*，另外在某些罕見的情況下細胞發(fā)生凋亡可無DNA斷裂。

(2)不能提供單個細胞或相關細胞的組織學定位或細胞分化等凋亡信息。

(3)不能進行準確定量，只能進行半定量。

(4)靈敏性較差，要求所測標本細胞數在1×106以上才能使電泳清晰。

(5)適用于只含有單一細胞成分標本的測定，對組織細胞組成復雜者，不能確定凋亡發(fā)生于哪類細胞。

三、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定

ELISA是定量檢測細胞凋亡的免疫化學法，其基本原理是利用夾心ELISA方法檢測細胞凋亡后形成的由組蛋白及DNA斷組成的核小體。在微定量板上吸附抗組蛋白抗體，加入細胞裂解后離心所得的含有核小體的上清液，核小體上的組蛋白與包被的抗組蛋白抗體結合；加入辣根過氧化物酶標記的抗DNA抗體，與核小體上的DNA結合；加酶的底物，測光吸收值。此方法敏感性高，所需細胞數少，可檢測低至5×10²/mL的凋亡細胞。此外，此方法不需特殊儀器，比較適合基層工作。

缺點：

(1)不能測定凋亡發(fā)生的量。

(2)適合單一成分細胞的檢測，對于多細胞成分的組織或細胞混合物，不能判定凋亡發(fā)生在哪種細胞。

(3)不能提供單個細胞或相關細胞的組織學定位。

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產品名稱       貨號    來源       規(guī)格

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熱滅活 FBS 10082-147 USA 500ML

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活性炭/葡聚糖FBS   12676-029 USA 500Ml

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蛋白酶K MercK   1245680100 100mg

G418 Life Invitrogen 11811-031 5g

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