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細胞培養前的準備

在您帶上手套開始細胞培養之前,先檢查一下移液管和瓶子的數量是否充足,以免在開始實驗后再次出入操作臺，這樣可以降低細胞污染的風險。

細胞培養基也應先預熱,選擇只預熱部分培養基而非整瓶加熱,不但可以節約實驗時間,而且可以避免因反復加熱培養基而造成的蛋白質降解。

結束操作后,別忘了培養基對光敏感,應盡可能避光保存。

細胞培養的定期檢查，定期檢查培養細胞的形態，即形狀和外觀，對于細胞培養實驗取得成功至關重要。

除確認細胞的健康狀態外，每次操作細胞時通過肉眼和顯微鏡檢查細胞還可早期發現污染征象，避免污染擴散至實驗室其他細胞。

細胞變質的征象包括核周出現顆粒、細胞與基質解離以及細胞質空泡形成。

這些變質征象可能為多種原因所致，例如：培養物污染、細胞系衰老或培養基中存在毒性物質，或者這些征象僅表明培養物需要更換培養基。

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一、傳代培養（消化法）

1、預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

2、用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手，嚴格進行無菌操作前的準備工作。

3、正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

4、點燃酒精燈：注意火焰適宜。

5、取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。

6、從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。

7、打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。

注意事項：嚴格的無菌操作過程

二、胰蛋白酶消化

1、加入消化液：小心吸出舊培養液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞zui好，zui佳消化溫度是37℃。

2、顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。

3、吸棄消化液加入培養液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。

注意事項：

適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

三、吹打分散細胞

1、吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。

2、吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。

3、平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。

4、棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

四、分裝稀釋細胞

1、分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。

2、顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×10^5/ml。zui后要做好標記。

五、繼續培養

用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋

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一、準備工作

1、將水浴鍋預熱至37℃

2、用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

3、在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等。

二、取出凍存管

1、根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

2、從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

三、迅速解凍

1、迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

2、約1-2min后凍存管內液體*溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。

四、制備細胞重懸液

1、離心（3000rpm,3min)后吸棄上清液。

2、向離心管內加入10ml培養液，吹打制成細胞懸液。

五、細胞計數

細胞濃度以5×10⁵/ml為宜。

六、細胞培養

將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃和5％CO2的培養箱內2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續培養，換液的時間由細胞情況而定。

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 當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。

一、準備工作

取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養（消化法）》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。

二、細胞懸液制備細胞懸液制備

細胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細胞懸液。

三、細胞計數

1、蓋好蓋玻片：取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上。

2、制備計數用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液（0.4％）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。

3、將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

4、統計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目。

5、計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度：

（細胞懸液的細胞數）/ml＝ （ 四個大格子細胞數/4) ×2×104

說明：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。

公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。

公式中乘以10^4因為計數板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm³ 而 1ml＝1000mm³

四、細胞計數要點

1、進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于10⁴個/ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中；

2、要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。

3、取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；

4、數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。

5、操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。

只要滿足以下兩個條件就可以進行細胞活力檢測，正常細胞的細胞膜是完整的。

Propidium iodide（PI碘化丙啶）是一種核酸染料，常用于細胞凋亡(apoptosis)或細胞壞死(necrosis)的檢測和流式細胞儀分析。PI不能通過正常完整的細胞膜，故細胞在處于壞死或晚期凋亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色，可以用來分辨壞死細胞/正常細胞。

加入另一種可以透過細胞膜的核酸染料，就可以通過兩種染料將活細胞和死細胞區分開。

PI經常被用來與Calcein-AM或者FDA等熒光探針一起使用，能同時對活細胞和死細胞染色。PI-DNA復合物的激發和發射波長分別為535 nm和615 nm。