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    HUVEC-人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

    2019-03-20 瀏覽次數(shù):1723

    HUVEC-人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 

    ★CQ★實(shí)驗(yàn)材料-新生兒臍帶

    試劑: PBS、膠原酶、M199培養(yǎng)基、胰酶、EDTA、DMEM培養(yǎng)基

    儀器、耗材:針頭、手術(shù)鉗、離心管、低溫離心機(jī)、彎管、明膠、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡

    ★CQ★步驟

    1.將 15-20cm 長(zhǎng)的新生兒臍帶放入無(wú)菌的 PBS 溶液中儲(chǔ)存。(注:4℃下多貯存 24 小時(shí),室溫下不超過(guò) 6 小時(shí),否則廢棄)

    2. 用一個(gè)鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中,用無(wú)菌的 PBS 溶液沖洗 3-5 次,將污血沖洗干凈為止。

    3. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端,加入 15ml 的膠原酶(1mg/ml)室溫下消化 15-20分鐘,并不時(shí)上下?lián)u動(dòng)臍帶。

    4. 消化完后,將下端手術(shù)鉗松開(kāi),消化液流入一個(gè) 50 ml 無(wú)菌離心管中,用無(wú)菌的 PBS 溶液沖洗臍帶 2-3 次。

    5. 將收集液離心(2000 轉(zhuǎn)/ 分)3 分鐘。

    6. 倒去上清,加入 10ml M199 培養(yǎng)基(加入 10U/ml 的 bFGF) ,用彎管吹散細(xì) 胞,將所有液體轉(zhuǎn)入一個(gè)用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng)。(注:每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入 3- 4ml 無(wú)菌的 1%的明膠溶液,搖勻使得明膠溶液* 鋪滿瓶底,放入 37℃孵育,少 2 小時(shí),用前將明膠溶液倒了即可,明膠包被 有利于細(xì)胞貼壁。 )

    7. 培養(yǎng) 24 小時(shí)后,倒掉培養(yǎng)基,并用無(wú)菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次,洗掉紅細(xì) 胞和死細(xì)胞,加入 10 ml 新鮮的 M199 培養(yǎng)基。

    8. 以后每 2 天換一次培養(yǎng)基(每次換掉 2/3 的培養(yǎng)基) 。

    9. 一般培養(yǎng) 5-7 天,細(xì)胞可長(zhǎng)滿至 80-90%單層,這時(shí)可以傳代。

    10. 倒掉培養(yǎng)基,用無(wú)菌的PBS 溶液清洗 2-3 次,加入2- 3ml 消化液(0.25%胰酶+0.1%EDTA)消化細(xì)胞,在顯微鏡下觀察,一旦細(xì)胞變圓,即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

    11. 用彎管將細(xì)胞吹打下來(lái),并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè) 50 ml 無(wú)菌離心管中,2000 轉(zhuǎn)/分,離心 3 分鐘。

    12. 倒掉上清,加入 10ml新鮮培基,一般一瓶細(xì)胞可傳代 3-4 瓶,以后照此傳代培養(yǎng)。

    13. 一般傳代 2-3 代(培養(yǎng)了 20 天左右)用于做各種實(shí)驗(yàn)效果zui

     

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